基因組學研究發現瞭能夠導緻腫瘤發生和進展的基因突變。部分緻癌突變會産生具有新活性的蛋白 能夠與其他蛋白産生新的相互作用 《細胞》：癌基因突變促癌的“暗箱操作”被華人科學傢“曝光”瞭 - 趣味新聞網

基因組學研究發現瞭能夠導緻腫瘤發生和進展的基因突變。

部分緻癌突變會産生具有新活性的蛋白，能夠與其他蛋白産生新的相互作用，從而發揮原蛋白所不具有的功能 。

如果能高通量地鑒定這種突變體産生的新蛋白間相互作用（neoPPIs），必然將為精準靶嚮藥物開發帶來極大便利。

5月4日，來自埃默裏大學醫學院的傅海安教授團隊在《細胞》雜誌發錶重要研究成果[1]。他們 開發瞭一個 高通量篩選平台――qHT-dS ，能夠鑒定突變體蛋白介導的neoPPIs 。基於qHT-dS，研究人員發現 高頻緻癌突變BRAFV600E能夠與KEAP1産生neoPPI，激活NRF2介導的氧化還原途徑 。

雖然之前有研究錶明，KEAP1-NRF2通路能夠清除細胞內的活性氧，幫助腫瘤細胞應對氧化應激，從而促進腫瘤細胞的生存和耐藥[2]；但是物極必反，研究人員發現這一通路的激活暴露瞭腫瘤細胞的一個弱點，即 對由NRF2調控的抗氧化因子――NAD(P)H:醌氧化還原酶1（NQO1）的特異性毒性底物格外敏感，從而提供瞭治療靶點 。

這項研究證明瞭腫瘤基因改變能夠産生新的蛋白間相互作用，為突變體指導的精準醫學治療提供瞭新策略。

論文首頁截圖

基因的錯義突變會産生新錶位，可能改變編碼蛋白的內在特性，誘導新的互作或減弱原有的互作。這種 新錶位誘發的差異蛋白互作（Df-PPIs）可能會重塑緻癌通路，從而影響腫瘤的生物學行為 。

即便是同一基因，不同的突變位點對腫瘤生物學行為的影響也不同[2]。在氨基酸水平研究突變體的臨床意義，既是挑戰也是精準醫療的需要。

此外，編碼轉接體蛋白和抑癌蛋白的基因突變是難以直接靶嚮的，這些蛋白主要通過與其他蛋白互作發揮功能[3]，因此 瞭解突變體如何改變蛋白互作網絡，將為治療提供下遊靶點 。

基因突變可能會改寫下遊信號通路

目前突變誘發neoPPIs的頻率和圖譜還沒有建立，主要的障礙是如何在活細胞中係統性地研究這些相互作用。為瞭解決這一問題，研究者們建立瞭一種基於生物發光共振能量轉移（BRETn）技術的平台qHT-dS，能夠在活細胞中高通量、定量地篩選産生neoPPIs的基因突變位點。

為瞭針對性地研究緻癌基因突變編碼蛋白和癌癥相關蛋白的相互作用，研究人員先是篩選瞭18個緻癌突變位點（包括2個緻癌基因和4個抑癌基因）和556個野生型癌癥相關基因，構建瞭過錶達文庫。

之後，研究人員在1536孔闆上建立瞭基於BRETn的超高通量PPI篩選體係：在HEK293T細胞中轉染帶有Nanoluc熒光素標簽的野生型（WT）或突變型（MUT）緻癌基因錶達質粒，作為BRETn的供者；轉染帶有Venus熒光蛋白標簽的癌癥相關基因錶達質粒，作為BRETn的受者。 要産生陽性的BRETn信號，供者和受者間距離需要小於10nm，因此能夠準確反應蛋白之間的直接作用 。

qHT-dS平台技術路綫圖

通過自動化的工作流程，研究者們係統地 測試瞭18個突變體蛋白及其對應的6個野生型蛋白與556種癌癥相關蛋白的兩兩相互作用 ，並通過自主開發的互作重塑比較分析算法（CARINA）鑒定齣瞭8839個蛋白互作。

緊接著，研究人員用較為嚴格的標準篩選齣高標準差異蛋白互作（HS-Df-PPIs），其中包括突變體相對於野生型增加的蛋白互作（HS-Go-PPIs）359個、減少的蛋白互作（HS-Lo-PPIs）13個。

如果從緻癌基因角度分析這些HS-Df-PPIs，會發現 同一基因的不同突變位點，甚至是同一突變位點的不同氨基酸殘基改變，所導緻的PPI網絡變化都有很大差異 。這一結果印證瞭在氨基酸殘基水平研究突變體意義的必要性。

此外，抑癌基因突變既有HS-Lo-PPI又有HS-Go-PPI，說明 抑癌基因的突變不僅導緻抑癌功能的失活，也會使其獲得新的活性 。而緻癌基因突變以Go-PPI為主，說明緻癌基因突變可能重塑緻癌通路或引起其他通路變化。

而從癌癥相關蛋白的角度分析，可以發現 35%的HS-Go-PPI夥伴蛋白與緻癌突變具有重現性的相互作用 （與3個或3個以上突變位點都有互作），這些蛋白富集在生長調控相關的通路，如細胞周期、PI3K/AKT/mTOR、JAK/STAT通路；而大部分（65%）的HS-Go-PPI夥伴蛋白隻與1-2個突變位點有互作，說明這是突變導緻的特異性改變。

左. 聚類分析揭示瞭重現性和突變特異性Df-PPI夥伴蛋白；右. 重現性Df-PPI夥伴蛋白通路富集分析

盡管qHT-dS平台有高通量和定量化的優點，但因為利用瞭熒光標簽和蛋白質過錶達係統，對化學測量有一定影響，得到的結果可能不符閤腫瘤細胞的實際情況。因此，有必要通過不使用熒光標簽的蛋白互作試驗對得到的HS-Df-PPIs進行驗證。

研究者們通過GST pull-down、NanoPCA、semi-IP、co-IP等一係列互補的試驗進行驗證。以BRAFV600E突變為例，有六個HS-Go-PPIs得到四個試驗同時支持，夥伴蛋白分彆是BCL2L1、GSK3A、KEAP1、PDCD2L、POLE和VHL。這些蛋白互作成為候選neoPPIs，值得進一步進行功能實驗。

對BRAFV600E突變HS-Df-PPIs的蛋白互作正交實驗驗證結果

研究人員以BRAFV600E/KEAP1這對蛋白互作為例進行瞭功能研究，結果發現 BRAFV600E通過增加與KEAP1的親和力，與NRF2競爭結閤KEAP1，從而釋放NRF2的活性，並增加其下遊NQO1的蛋白錶達和活性 。

NQO1是一種控製醌代謝的還原酶，能夠解毒外源性醌化閤物，清除細胞內的超氧化物，具有廣泛的細胞保護作用[4]。NQO1在腫瘤細胞中常常過錶達，並且與腫瘤轉移和不良預後相關[5]。

研究者們檢驗瞭一種NQO1特異性的毒性底物DNQ對細胞生存的影響，結果發現 攜帶BRAFV600E突變的細胞生長抑製比WT更明顯 。而在DNQ處理細胞後，再加用BRAF抑製劑vemurafenib，兩藥展現齣明顯的協同作用。

因此，BRAFV600E與KEAP1的neoPPI激活瞭NRF2介導的氧化還原途徑，上調瞭NQO1錶達，從而讓腫瘤細胞對NQO1毒性底物更加敏感。 新發現的NQO1毒性底物與vemurafenib的聯閤治療策略值得進一步探索 。

BRAFV600E/KEAP1 neoPPI重塑氧化還原途徑的機製以及暴露的治療靶點

總的來說，本研究開發瞭高通量、定量鑒定neoPPIs的技術平台，精準繪製瞭緻癌突變位點導緻的Df-PPIs圖譜，揭示瞭基因突變引起neoPPIs的普遍性，以及同一基因不同突變位點所産生的neoPPIs的差異。

對BRAFV600E/KEAP1 neoPPI的功能研究發現瞭氧化還原通路的潛在治療靶點NQO1。其他候選neoPPI值得未來進一步探索，將為開發突變位點導嚮的精準治療策略提供極大幫助。

參考文獻：

1. Mo X, Niu Q, Ivanov AA, Tsang YH, Tang C, Shu C, Li Q, Qian K, Wahafu A, Doyle SP, Cicka D, Yang X, Fan D, Reyna MA, Cooper LAD, Moreno CS, Zhou W, Owonikoko TK, Lonial S, Khuri FR, Du Y, Ramalingam SS, Mills GB, Fu H. Systematic discovery of mutation-directed neo-protein-protein interactions in cancer. Cell. 2022 Apr 27:S0092-8674(22)00461-5. doi: 10.1016/j.cell.2022.04.014. Epub ahead of print. PMID: 35512704.

2. Taguchi K, Yamamoto M. The KEAP1-NRF2 System in Cancer. Front Oncol. 2017 May 4;7:85. doi: 10.3389/fonc.2017.00085. PMID: 28523248; PMCID: PMC5415577.Burd CE, Liu W, Huynh MV, Waqas MA, Gillahan JE, Clark KS, Fu K, Martin BL, Jeck WR, Souroullas GP, Darr DB, Zedek DC, Miley MJ, Baguley BC, Campbell SL, Sharpless NE. Mutation-specific RAS oncogenicity explains NRAS codon 61 selection in melanoma. Cancer Discov. 2014 Dec;4(12):1418-29. doi: 10.1158/2159-8290.CD-14-0729. Epub 2014 Sep 24. PMID: 25252692; PMCID: PMC4258185.

3. Arkin MR, Tang Y, Wells JA. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing toward the reality. Chem Biol. 2014 Sep 18;21(9):1102-14. doi: 10.1016/j.chembiol.2014.09.001. PMID: 25237857; PMCID: PMC4179228.

4. Zhang K, Chen D, Ma K, Wu X, Hao H, Jiang S. NAD(P)H:Quinone Oxidoreductase 1 (NQO1) as a Therapeutic and Diagnostic Target in Cancer. J Med Chem. 2018 Aug 23;61(16):6983-7003. doi: 10.1021/acs.jmedchem.8b00124. Epub 2018 May 7. PMID: 29712428.

5. Beaver SK, Mesa-Torres N, Pey AL, Timson DJ. NQO1: A target for the treatment of cancer and neurological diseases, and a model to understand loss of function disease mechanisms. Biochim Biophys Acta Proteins Proteom. 2019 Jul-Aug;1867(7-8):663-676. doi: 10.1016/j.bbapap.2019.05.002. Epub 2019 May 12. PMID: 31091472.

責任編輯丨BioTalker